单细胞转录组和单细胞免疫组库测序共同揭示胆道闭锁的肝脏免疫特征

从6个BA的婴儿和10个对照样本（6个胆管囊肿（CC）的婴儿及4个正常样本）的外周血（PBMC）和肝脏活检组织中，采用荧光免疫分选法(FACS)分选免疫细胞，一共对159,622个单细胞进行了转录组测序，同时对10个样本均进行了单细胞免疫组库测序（Single-cell V(D)J profiling）。

对测序的159,622个单细胞进行质控后，细胞分群及细胞注释共鉴定了11个细胞类型，如CD4 T细胞、CD8T细胞、B细胞、浆细胞、浆母细胞等（图2E），其中，包括主要的免疫细胞T细胞和B细胞两大类（图2F）。

对T细胞进行单独聚类，发现了17个细胞亚型及其标记基因（图3A，3B）。其中，在5类CD4⁺ T细胞亚型中，cTh1细胞同时表达Th1和细胞毒T细胞的标记基因，而ex-cTh17细胞则同时表达细胞毒T细胞, Th17和Th1细胞类型的标记基因（图3B）。相对于正常样本，BA患者肝脏组织的cTh1和ex-cTh17细胞丰度升高（图3C）。TCR共有克隆型分析则显示BA患者体内的ex-cTh17和cTh1细胞间的转换加剧，基因表达比较分析显示ex-cTh17 和cTh1 cells二者之间呈现共同的表达特征。

TCR克隆型分析还表明BA患者的CD8Trm细胞表现出明显的TCR克隆扩张（图3D），这种克隆扩张可能由TCF7⁺LEF1⁺CXCR3⁺XCL1⁺干细胞样记忆CD8 T细胞（CD8Tscm）、MKI67⁺有丝分裂CD8 T细胞和CX3CR1⁺CD8Teff细胞导致。对于肝脏组织的快速增殖的CD8 T细胞表型检查，证实了CX3CR1⁺CD8Teff细胞类型在BA婴儿体内快速下降。研究还发现BA患者体内的CX3CR1⁺CD8Teff细胞的ASCL2, KLF2, CX3CR1和S1PR1表达明显降低，研究还证实了当与肝脏星型细胞株共表达时，CX3CR1⁺CD8Teff细胞可抑制纤维化基因表达（COL1A1和COL1A2）。

BA样本肝脏的细胞毒性升高及CX3CR1⁺CD8T细胞丰度降低

我们鉴定了5类先天性淋巴细胞（innate lymphocytes, ILCs）和两类非传统的T细胞（cir-NKT和lr-NKT）（图4A和4B）。与CX3CR1⁺CD8Teff 细胞类似，cir-NK细胞不仅同样被ASCL2和KLF2激活（图4C），且激活引起的细胞编程也用共同之处（图4D、4E）。然而，研究发现促使cir-NK细胞迁移的转录因子及其受体的表达在BA组和对照组中无差别（图4G），为了探究BA者内cir-NK细胞的损失的可能机制，研究发现BA体内肝脏的CX3CL1浓度明显降低（图4H），这也被RRV-诱导的BA模型证实。细胞毒性淋巴细胞（T细胞核NK细胞）可以促进颗粒酶介导的目标细胞凋亡，对肝成纤维细胞（α-SMA⁺）的颗粒酶B共染色实验发现BA的共沉淀明显降低（图4I）。总之，这些结果表明CX3CR1和CX3CL1调节的对成纤维细胞杀伤降低会导致BA婴儿的肝脏纤维化。

我们鉴定了9类髓系细胞，包括3类单核细胞、3类DC细胞以及库普弗细胞（Kupffer cells）和有丝分裂髓样细胞（图5A和图5B），其中，cDC1和Kupffer细胞主要来源于肝脏（图5C）。与对照相比，我们发现BA组的髓系细胞炎症和趋化性被抑制（图5D）。此外，库普弗细胞清除基因MARCO和CD5L表达降低，这也被体外实验所证实（图5E）。BA样本肝脏组织的主要炎症细胞因子，如TNFSF8/ CHI3L1、TNFSF13B（BAFF）、IL-8和 MMP-2都明显降低，表明巨噬细胞的炎症反应衰退 (图5F)。进一步研究表明胆汁酸的积累并通过结合细胞表明受体TGR5（由GPBAR1编码）来抑制BA患者的肝髓样细胞的炎症反应（图5G，5H和5I）。

与以往研究不同，本研究发现出生后现肝脏B淋巴细胞的增殖仍然保留。通过对照和BA样本肝脏组织的细胞聚类，发现了发育相关的CD34⁺造血干细胞(HSCs)、pre-pro-B细胞、 组细胞(pro-B)、 前体(pre-B)、非成熟B细胞、浆母细胞(PB)及浆细胞(PCs)等B细胞亚型 (图6A和6B)。对从肝脏、骨髓和PBM分选的HSCs、祖B细胞、前体B细胞和不成熟B细胞(CD10⁺ B 细胞)进行bulk RNA测序及免疫萤光染色实验进一步证明了肝脏B细胞的增殖功能（图6C和6D），且这种淋巴增殖至少持续出生后4个月（图6E）。研究还表明人类的骨髓样B细胞可表达自免疫B细胞表面受体（BCRs）。BA与对照样本相比，其可变区的体细胞高频突变(SHM)（图6F）和类别转换重组（CSR）（图6G）在记忆性B细胞、PB细胞和PC细胞中明显降低。CSR的降低可能与BA婴儿的T细胞和NK细胞的TNFSF8 (CD30L)表达升高相关（图6H）。此外，对抗体的Isotype研究还发现BA婴儿肝脏组织更易出现自免疫的IgGs积累。

为了测试B细胞调整治疗是否可以减轻肝脏损伤，研究者对RRV-诱导的BA小鼠模型进行实验。试验表明小鼠在11天时出现了肝脏B淋巴细胞扩增，然后通过抗CD20抗体（RTX治疗）或者敲除MHC-class I/II介导的抗原呈递，可以明显的降低黄疸的发生率，表明这种治疗策略的有效性。为了揭示RTX治疗的引起的免疫变化，研究者还对三个RTX-治疗的样本进行了共42254个单细胞的转录组、BCR和TCR测序，表明经过RTX治疗的样本，会出现表达CD20的B细胞会被有效的消耗、CD8Trm细胞的丰度和克隆扩张降低等变化。

本研究采用10x单细胞转录组和免疫组库测序技术联合揭示了胆道闭锁疾病的免疫细胞图谱特征，特别是T细胞、B细胞以及其他免疫细胞在疾病状态下的细胞丰度、基因表达谱以及免疫克隆型等的变化，进一步揭示了免疫与胆道闭锁的关系，并为疾病的治疗提供了重要参考。